IEC - Perguntas e respostas recentes em Protocolos

Respondida: Onde encontro protocolos experimentais detalhados?

Tue, 12 Mar 2024 12:56:10 +0000

Hoje conheci a plataforma PubCompare.Ai (https://www.pubcompare.ai/), que facilita a busca de protocolos diretamente de artigos publicados. Extraído do site:

Our mission is to provide scientists with the largest repository of trustworthy protocols and intelligent analytical tools, thereby offering them extensive information to design robust protocols aimed at minimizing the risk of failures.

Os procedimentos são os descritos nas próprias publicações, sucintos e às vezes sem detalhes importantes. De qualquer modo, a plataforma é útil para encontrar protocolos relevantes, particularmente alguns descritos muito recentemente.

Respondida: Como efetuar titulação de partículas lentivirais para transdução celular?

Mon, 02 Mar 2020 18:49:49 +0000

O protocolo a seguir é bastante completo. Em Fevereiro de 2020 efetuamos síntese dos primers sugeridos para tentarmos padronizar essa abordagem de quantificação de partículas lentivirais.

Kutner RH, Zhang X-Y, Reiser J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc 4:495–505, 2009. DOI:10/d9jcnw | PMID: 19300443.

Oligonucleotídeos necessários para quantificação lentiviral:

PMID19300443_GAG.F - TTCGCAGTTAATCCTGGCCTT
PMID19300443_GAG.R - GCACACAATAGAGGACTGCTATTGTA
PMID19300443_WPRE.F - CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT
PMID19300443_WPRE.R - GCAGAATCCAGGTGGCAACA

Respondida: Como efetuar indução de ciclo lítico viral em células infectadas pelo EBV ou KSHV?

Wed, 06 Feb 2019 18:36:05 +0000

Para o EBV, informações postadas para o grupo em 20190206:

O documento a seguir apresenta as instruções de base para a indução química de ciclo lítico do EBV.
[Protocolo] Indução ciclo lítico EBV (TPA ou TP...
Segue referência da fonte e pdf do doc na íntegra, que contém outros protocolos e informações muito relevantes para manipulação do EBV e células constitutivamente infectadas.
Lan K, Verma SC, Murakami M, Bajaj B, Robertson ES. Epstein-Barr Virus (EBV): infection, propagation, quantitation, and storage. Curr Protoc Microbiol. (Chapter 14:Unit 14E.2). PMID: 18770612.
(!) EBV - Infection, Propagation, Quantitation,...

Respondida: Proteínas com etiqueta FLAG: que condiçoes de western blot utilizar inicialmente?

Mon, 06 Aug 2018 19:49:21 +0000

Eis procedimento utilizado previamente no grupo para detecção de KSHV K1-FLAG:

As células HEK293 estavelmente transfectadas com vetores recombinantes de ORF-K1 do KSHV foram submetidas à extração de proteínas totais com reagente M-PER® Mammalian Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) contendo coquetel de inibidores de proteases Halt^TM Protease Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), conforme instruções do fabricante. A concentração de proteínas foi estimada por leitura espectrofotométrica à 655nm empregando-se o kit comercial DC Protein Assay kit II (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) segundo instruções do fabricante. Lisados proteicos contendo 100mg proteínas totais de cada amostra foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida com duodecil sulfato de sódio (Sodium Duodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis - SDS-PAGE) e transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (polyvinylidene fluoride – PVDF) (Millipore, Billerica, MA, USA) empregando equipamento Trans-Blot Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
A detecção de K1 nas membranas produzidas foi efetuada por meio de incubação com anticorpo primário monoclonal anti-FLAG^®M2 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 1:5000 overnight, seguida de incubação com o anticorpo secundário antifragmento Fab2 de IgG de camundongo conjugada a peroxidase e produzida em carneiro (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) a 1:4000 por 4h. Em paralelo foi efetuada detecção da cadeia beta da actina humana por meio de incubação com anticorpo monoclonal anti-β-actina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 1:5000 overnight, seguida de incubação com o anticorpo secundário antifragmento Fab2 de IgG de coelho conjugada a peroxidase e produzida em asno (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) a 1:4000 por 2h. A detecção de sinal no experimento de western blot foi efetuada por quimiluminescência com reagente Pierce ECL (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Fonte: Annie Cristhine Moraes Sousa. Produção de vetores recombinantes para análise das propriedades biológicas e cancerígenas da proteína K1 do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV/HHV-8). 2014. Dissertação (Mestrado em Pós Graduação Em Patologia) - Faculdade de Medicina de Botucatu, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior. Orientador: Deilson Elgui de Oliveira.

Respondida: Como efetuar ensaio para análise de migração e invasão celular in vitro?

Fri, 02 Mar 2018 13:38:23 +0000

BiteSizeBio | Beginners Guide to Setting Up Migration and Invasion Assays - https://goo.gl/MkkXB2

So you have a gene or protein that you think may be involved in migration or invasion and the next step is to embark on migration assays. These assays are useful for testing fundamental migratory processes, such as embryonic development, immune response, metastasis and angiogenesis. For a long time these have been an invaluable mainstay of cancer research, however, gaining consistent results from such assays can be tricky, especially if handling 3D-matrices is not in your repertoire…yet! Here are some tips and tricks to ensure the best results from your migration assays.

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