O procedimento pressupõe atividades em 5 dias consecutivos, de modo que requer 1 semana para sua conclusão. A cronoloogia abaixo é detalhada a seguir.
| 0h |--------------| 28h |--------| 44h |------------| 68h |------------| 92h |
DIA 1 (Segunda-feira) - Plaqueamento e sincronização celular
|0h| Às 12h, plaquear BC-3 a 5x10^5/mL em meio (RPMI 1640 + 20% FBS) acrescido de 1% DMSO
DIA 2 (Terça-feira) - Crescimento celular
|28h| Às 16h, lavar células com PBS e ressuspender em meio sem DMSO
DIA 3 (Quarta-feira) - Indução de ciclo lítico com TPA
|44h| Às 08h, adicionar solução TPA a 100ng/mL (preparado em DMSO)
DIA 4 (Quinta-feira) - Avaliação de expressão gênica
|68h| (24h de tratamento com TPA) Às 08h, retirar células para extração de RNA [1]
DIA 5 (Sexta-feira) - Obtenção de sobrenadante com partículas virais infectantes
|92h| (48h de tratamento com TPA) Às 08h, retirar sobrenadante para obtenção de vírions do KSHV. Usar células para extração de RNA, se desejado. [1]
[1] Segundo resultados dos autores do trabalho no qual se baseia o procedimento apresentado, a quantidade RNA viral aumenta em 16-24h pós-indução com TPA, enquanto o número de vírions no nobrenadante é maior após 24h de tratamento.
O procedimento foi delineado com base nos resultados apresentados no trabalho abaixo indicado:
Ma W , Galvin TA, Ma H, Ma Y, Muller J, Khan AS. Optimization of chemical induction conditions for human herpesvirus 8 (HHV-8) reactivation with 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA) from latently-infected BC-3 cells. Biologicals. 2011 Apr 4. [PMID: 21470875]