As células HEK293 estavelmente transfectadas com vetores recombinantes de ORF-K1 do KSHV foram submetidas à extração de proteínas totais com reagente M-PER® Mammalian Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) contendo coquetel de inibidores de proteases HaltTM Protease Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), conforme instruções do fabricante. A concentração de proteínas foi estimada por leitura espectrofotométrica à 655nm empregando-se o kit comercial DC Protein Assay kit II (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) segundo instruções do fabricante. Lisados proteicos contendo 100mg proteínas totais de cada amostra foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida com duodecil sulfato de sódio (Sodium Duodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis - SDS-PAGE) e transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (polyvinylidene fluoride – PVDF) (Millipore, Billerica, MA, USA) empregando equipamento Trans-Blot Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
A detecção de K1 nas membranas produzidas foi efetuada por meio de incubação com anticorpo primário monoclonal anti-FLAG® M2 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 1:5000 overnight, seguida de incubação com o anticorpo secundário antifragmento Fab2 de IgG de camundongo conjugada a peroxidase e produzida em carneiro (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) a 1:4000 por 4h. Em paralelo foi efetuada detecção da cadeia beta da actina humana por meio de incubação com anticorpo monoclonal anti-β-actina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 1:5000 overnight, seguida de incubação com o anticorpo secundário antifragmento Fab2 de IgG de coelho conjugada a peroxidase e produzida em asno (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) a 1:4000 por 2h. A detecção de sinal no experimento de western blot foi efetuada por quimiluminescência com reagente Pierce ECL (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).